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    徠卡顯微鏡 - 熒光壽命成像之FLIM-FRET應用淺析

    2020-09-04 09:57:49 admin
    奧林巴斯顯微鏡

    FRET 技術(Fluorescence Resonance Energy Transfer)能夠在突破傳統光學分辨率極限的條件下研究蛋白互作、構象變化(<10 nm),或者通過構建 FRET 探針監測分子變化,因而在諸多研究領域得到了“科研大拿”們的青睞。然而,傳統的基于熒光強度的 FRET 技術(如 FRET-AB、FRET-SE 等)容易受到熒光蛋白濃度、激光強度、熒光漂白等眾多因素的影響,從而直接導致了實驗結果的不準確性和難重復性,著實讓人頭疼!


    奧林巴斯顯微鏡

    △ 圖1. 常用 FRET 染料對 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 圖表



    FLIM 顯微成像技術

    FLIM-FRET 的優勢

    FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一項基于熒光壽命(電子駐留在激發態的時間統計值)的顯微成像技術。與熒光光譜一樣,熒光壽命也是熒光物質的一種內在特有性質,不受熒光物質濃度、激發光強度等因素的影響。基于熒光壽命測量的 FRET 技術—— FLIM-FRET,具有 FLIM 和 FRET 兩者的優勢,即能在不受熒光強度影響因素影響的條件下,在納米分辨率水平對蛋白互作進行研究,或者通過 FRET 探針研究分子環境變化,更重要的是其測量數據準確性高、易重復,接下來我們來看兩個例子。


    案例解析


    案例一

    離子溶度監測

    今年發表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 細胞中的重要作用。


    作者通過對免疫缺陷病人進行基因篩查,發現了 ZIP7 蛋白的缺失,利用 CRISPR-CAS9 技術構建了該基因缺失的小鼠模型,并利用該模型證明了 ZIP7 缺失會導致 B 細胞發育受阻。ZIP7 介導 Zn2+ 由內質網流入細胞質,為了證明 ZIP7 缺失的細胞中 Zn2+ 濃度受到了影響,作者通過 FRET 探針 eCALWY-4、eCALWY-6 進行了研究,然而傳統的FRET技術會受到探針濃度的影響從而導致結果不準確,因此作者利用了 FLIM-FRET 技術,證明 ZIP7 突變體細胞質中 Zn2+ 濃度明顯下降,后續的實驗進一步證明了 ZIP7 調控的 Zn2+ 水平對 B 細胞發育的重要性。

    奧林巴斯顯微鏡

    △ 圖2. 利用 FLIM-FRET 技術檢測細胞質和內質網中 Zn2+ 濃度。P198A Hom,ZIP7 突變體;eCALWY-4、eCALWY-6 ,Zn2+  FRET reporters ; ER,內質網



    案例二

    活體功能成像

    FRET 探針不僅可用在細胞水平,in vivo 個體水平也同樣適用。


    “Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探針對小鼠小腸、胰腺等組織中的 Rac1 活性進行了監測。然而,傳統的 FLIM 技術成像速度非常慢,在活體應用時,由于時間分辨率不夠會導致數據的假象。該文通過算法將這種成像速度不夠導致的假象進行了*大程度的消除,從而在一定程度上促進了 FLIM 在活體水平的應用,該文章發表在2018年 eLife 雜志上。

    奧林巴斯顯微鏡

    △ 圖3. 左,Rac1 FRET 探針檢測小腸隱窩處 Rac1 活性模式圖;右,運動補償運算前后 FLIM 數據對比



    SP8 FALCON *快速熒光壽命成像

    解決 FLIM 成像速度*大瓶頸

    當然, FLIM 應用并不僅限于 FLIM-FRET,通過 FLIM 還可以對樣本所處的微環境進行檢測、對樣品組份進行分離等等。在傳統的熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎上,又增加了熒光壽命這一新的成像維度,大大拓展了該系統的應用范圍。


    然而,正如 Sean C Warren eLife 文章所說,FLIM 成像速度慢是限制其應用的*大瓶頸。


    Leica*新 SP8 FALCON *快速熒光壽命成像解決方案,使 FLIM 成像速度提升了近10倍(較經典 TCSPC 方法),近共聚焦的成像的速度幾乎能滿足所有動態過程的速度要求,可輕松實現 XYZTλ 多方式快速熒光壽命成像。

    △ 視頻1. 對 Alexa Fluor 555 溶液中的熒光小球(品紅色)進行快速熒光壽命成像。

    使用FLIM比熒光強度(左)更有利分離目標。單幀大?。?12 x 64 像素。比例尺:10 微米


    同時,該系統基于 Leica SP8 共聚焦成像平臺,可與白激光 STED 3X 納米顯微鏡、DIVE 多光子系統等相結合,形成基于一個平臺的 STED-FLIM、DIVE-FLIM 多模態成像。


    參考文獻:

    1. Consuelo Anzilotti et.al., Nature Immunology, 2019 Vol 20 350-361, An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development.

    2. Sean C Warren et.al., eLife, 2018 7:e35800, Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data. 

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